HRZZ Research Projects
(IP-06-2016)
Research project proposal: “Exploring the borderland between neurodegeneration and neuroregeneration: identification of key molecules with proteomics and functional assays in the mammalian spinal cord”
DefineREgenAgeMode
Principal Investigator (PI): prof. Miranda Mladinić Pejatović
One of the major challenges of modern biology concerns the inability of the adult mammalian central nervous system (CNS) to regenerate and repair itself after injury. Unlike the situation in adult mammals, lower vertebrates, such as fish and amphibians, and embryonal higher vertebrates can regenerate significant portion of their CNS. It is poorly understood why regenerative potential is lost with evolution and development and why it becomes very limited in adult mammals. Even though our understanding of molecular and cellular mechanisms promoting or inhibiting neuronal regeneration is expanding, it is still unclear what are the key differences between the neuronal systems that can and cannot regenerate, and how they can be manipulated as to revert the outcome. Our incomplete understanding of molecular events underlying neuronal development and regeneration is the main reason why neurodegenerative diseases and brain and spinal cord injuries are still mostly incurable today.
New achievements in the field suggest that differences in regeneration ability are due to alterations in several key attributes and not a single trait, and thus recent strategies employed to enhance regeneration in the mammalian CNS include the neutralization of potential growth inhibitory molecules combined with the transplantation of cells or materials that support axonal elongation and the delivery of factors that are known to promote axonal growth. These approaches are showing promising results, although have so far failed to produce robust axon regeneration. Moreover, the functional recovery was often limited and never enough to remedy neurological deficits. Full knowledge of the molecules that promote or prevent regeneration and the way they interact is far from complete.
A preferred model to study and reveal the cellular and molecular basis of regeneration is neonatal opossum (Monodelphis domestica). Opossums are marsupials that are born at very immature stage with unique possibility to successfully regenerate spinal cord after injury in the first two weeks of their life. After that, the regenerative capacity is abruptly lost: at 14 days in cervical spinal segments and at 17 days in less mature lumbar spinal segments. Neonatal opossums represent the unique opportunity to achieve and study mammalian CNS that can regenerate, without a need of invasive intrauterine surgery of pregnant females (as necessary for other mammalian laboratory animals, such as mice or rats). Moreover, the tiny neonatal opossum CNS can be maintained in culture in its entirety and this preparation is similar to the intact animal in its ability to regenerate.
In this project we will use neonatal opossum to study molecular and cellular properties of spinal tissue which has and has not the capacity to regenerate after injury, to pinpoint the key differences. First, we will use the comparative proteomic approach to identify the proteins differentially distributed in opossum spinal tissue with different regenerative capacities. The results will upgrade our previous data about the genes differentially expressed in the regenerating and non-regenerating opossum spinal cord tissue. The comparison of the data obtained by genomic and proteomic approach will allow the selection of the several most promising candidates controlling regeneration, to be tested in functional studies. The choice of the candidate molecules will be based on the hypothesis that changes in spinal radial glia / stem / progenitor cells and extracellular matrix are determinant for the regeneration loss during development. The activity of the candidate proteins will then be manipulated to reveal their role in regeneration in two different in vitro preparations: intact neonatal opossum spinal cord preparation (to easily visualize the axonal growth as to test regeneration capacity of the tissue) and primary spinal cell cultures (to easily genetically manipulate candidate molecules for testing their impact on regeneration-related stem cell properties). The selected candidate molecules will be tested simultaneously, in different combinations, to allow the alterations in several key attributes related to regeneration (stem cell activity and axonal growth promoting or inhibiting molecules).
This original interdisciplinary basic research project, unique in the choice of the animal model to be used, combines advanced techniques of biotechnology and molecular and cellular neurobiology to identify the molecular and cellular differences in mammalian CNS tissue that can and cannot regenerate. The results of the project would make substantial contribution to our understanding of neuronal regeneration in mammals, and also provide candidate targets for future novel therapeutic interventions for neurodegenerative disorders.
Istraživanje granice između neurodegeneracije i neuroregeneracije: identifikacija ključnih molekula pomoću proteomike i funkcionalnih testova na leđnoj moždini sisavaca
DefineREgenAgeMode
Voditeljica projekta (PI): izv.prof.dr.sc. Miranda Mladinić Pejatović
Jedan od glavnih izazova s kojim je suočena suvremena neurobiologija je nemogućnost regeneracije središnjeg živčanog sustava (SŽS) odraslih sisavaca nakon ozljede. Za razliku od odraslih sisavaca, niži kralježnjaci kao što su ribe i vodozemci, te viši kralježnjaci tijekom embrionalnog razvoja imaju sposobnost obnove značajnog dijela SŽS. Još uvijek nije jasno kako se i zašto sposobnost regeneracije gubi tijekom evolucije i razvoja, te zašto regeneracija kod odraslih sisavaca postaje iznimno ograničena. Iako se naše razumijevanje staničnih i molekularnih mehanizama koji potiču ili inhibiraju regeneraciju zadnjih godina sve više produbljuje, još uvijek je nejasno koje su to ključne razlike između živčanih sustava koji imaju i onih koji nemaju sposobnost regeneracije, te kako ih manipulirati sa ciljem da se promjeni ishod ozljede. Naše nepotpuno razumijevanje molekularnih događaja koji su temelj razvoja i regeneracije živčanog tkiva je glavni razlog zašto su neurodegenerativne bolesti kao i ozljede mozga i leđne moždine danas još uvijek neizlječive.
Nova postignuća u ovom području istraživanja ukazuju da sposobnost regeneracije ovisi o nekoliko ključnih promjena, te stoga strategije koje nastoje pospješiti regeneraciju u SŽS sisavaca kombiniraju neutralizaciju potencijalnih inhibitora živčanog rasta, s istovremenom transplantacijom stanica ili materijala koji omogućavaju rast aksona, te uvođenje molekularnih čimbenika koji pozitivno utječu na njihov rast. Rezultati ovih pristupa su obećavajući, iako se do sada njima nije uspjelo potaknuti snažnu regeneraciju aksona, a funkcionalni je oporavak
često ograničen i nedovoljan za izlječenje neuroloških nedostataka. Naše znanje o molekulama koje potiču ili sprječavaju regeneraciju, te o načinu na koji one međusobno djeluju je zasad nepotpuno i nedovoljno.
Prikladan model za proučavanje i otkrivanje stanične i molekularne osnove regeneracije je mladi oposum (Monodelphis domestica). Oposumi su tobolčari koji se rađaju nerazvijeni, pa tijekom prva dva tjedna svog života posjeduju jedinstvenu sposobnost potpune regeneracije leđne moždine nakon ozljede. Nakon toga sposobnost regeneracije se naglo gubi: oko 14. dana u vratnom dijelu leđne moždine, te 17. dana u njenom manje razvijenom lumbalnom dijelu. Mladi oposum daje jedinstvenu priliku za istraživanje SŽS sisavaca koji ima sposobnost regeneracije, bez potrebe za invazivnim operacijama trudnih ženki (kao što je potrebno kod ostalih laboratorijskih sisavaca kao što su miševi ili štakori). Štoviše, cjeloviti SŽS novorođenog oposuma može se održavati u kulturi, pri čemu se u potpunosti zadržava njegova sposobnost regeneracije.
U ovom projektu koristitimo mlade oposume za istraživanje molekularnih i staničnih svojstava tkiva leđne moždine koje ima sposobnost regeneracije nakon ozljede, te onog koje nema, kako bi se odredile ključne razlike. Prvo ćemo uporabom komparativne proteomike odrediti bjelančevine koje su različito raspoređene u tkivu leđnih moždina oposuma različitih regenerativnih sposobnosti. Dobiveni će se rezultati nadograditi na prethodna istraživanja podnositeljice prijedloga vezane za gene različito izražene u tkivu leđne moždine oposuma koje ima i koje nema sposobnost regeneracije. Usporedba podataka dobivenih pristupima genomike i proteomike omogućiti će odabir nekoliko najzanimljivijih molekula koje bi mogle imati važnu ulogu u kontroli regeneracije i koje će se testirati dalje, kako bi se ta njihova uloga i dokazala. Izbor molekula koje bi mogle biti važne za regeneraciju temeljit će se na pretpostavci da su promjene u radijalnim glija/matičnim/praroditeljskim stanicama, te izvanstaničnom matriksu leđne moždine ključne za gubitak sposobnosti regeneracije živčanog tkiva tijekom razvoja. Aktivnost odabranih molekula eksperimentalno će se mijenjati kako bi se otkrilo imaju li one utjecaja na regeneraciju. Pri tome će se koristiti dva različita in vitro preparata: preparat cjelovite leđne moždine mladog oposuma održavan u kulturi (kako bi se jednostavno vizualizirao rast aksona i testirala regenerativna sposobnost tkiva), te primarne stanične kulture leđne moždine (kako bi se genetski manipulirale odabrane molekule, te testirao njihov utjecaj na regenerativna svojstva matičnih i drugih stanica). Odabrane molekule ispitivat će se pojedinačno ili u različitim kombinacijama, kako bi se omogućile promjene ključnih svojstava vezanih za regeneraciju (aktivnost matičnih stanica, aktivnost molekula koje potiču ili inhibiraju rast aksona). Ovaj originalni interdisciplinarni temeljni istraživački projekt, jedinstven u odabiru životinjskog modela koji će biti korišten, kombinira napredne tehnike biotehnologije i molekularne i stanične neurobiologije kako bi se identificirale ključne molekularne i stanične razlike u SŽS sisavaca koji imaju i onih koji nemaju sposobnost regeneracije. Rezultati ovog projekta mogli bi dati izniman doprinos našem razumijevanju regeneracije živčanog tkiva sisavaca, te će pružiti potencijalne mete za razvoj budućih novih strategija u liječenju neurodegenerativnih poremećaja.